卵巢的成长

卵巢从形成后即进入缓慢的生长过程，并在此过程中由髂窝下缘缓慢下降至盆腔,体积逐渐增大。卵巢的生长过程伴随着卵泡的发生过程,始基卵泡持续激活,卵泡数目不断减少，但由于早期缺乏下丘脑、垂体激素的支持,卵泡只能发育到窦前卵泡阶段,少数能发育至排用前卵泡,但都最终闭锁。此时的卵巢具有一定的激素分泌功能,但水平较低。卵巢由多种细胞成分组成，不同细胞成分的相互作用在卵泡的发育成熟和卵巢的成长过程中发挥重要作用。

一、卵泡及其周围环境

卵泡是一个由卵母细胞和其周围的颗粒细胞及卵泡膜细胞共同组成的多细胞功能单元,是卵巢的生命源泉,卵泡的数量和质量直接影响着卵巢的生命力。卵泡中的卵母细胞与周围细胞通过细胞间连接运输代谢产物，并通过一系列细胞因子以旁分泌及自分泌的方式相互调节,主要包括TGF-β家族成员。卵巢中的其他成分对卵泡的存活和生长同样重要，其中卵巢基质为生长卵泡中产生的生长因子和调节因子提供屏障。此外，卵巢上皮细胞、免疫细胞及神经调节因素也在卵巢中发挥重要作用。

(一)卵母细胞

卵母细胞是罕见的巨大细胞,其细胞核较大,且具有高转录活性,也被称为“生发泡”。卵母细胞的细胞质含有丰富的细胞器以及蛋白质。在卵泡的生长过程中，卵母细胞的关键任务是产生供排卵、受精以及积蓄着床前胚胎形成新基因并开始转录所需要的所有成分。卵母细胞中基本的细胞质成分包括核糖体、线粒体和母体mRNA，这些成分在卵母细胞生长的过程中不断累积，为卵母细胞成熟和胚胎发育提供必需的蛋白质。由角蛋白、微管蛋白和其他高度丰富的卵母细胞蛋白组成的细胞质中含有丰富的核糖体和母体mRNA。卵母细胞与体细胞线粒体在结构和DNA含量方面具有显著不同。体细胞线粒体是球形的，几乎没有嵴，并且每个细胞只含有1~2个线粒体DNA。卵母细胞含有比体细胞更多的线粒体。在形成原始生殖细胞时大约含有10个线粒体，而每个原始卵母细胞含有高达6000个线粒体，在生殖细胞迁移到性腺、进入减数分裂和始基卵泡形成的整个过程中，线粒体的数量迅速增加。随着卵母细胞生长的开始，线粒体继续复制，在完全成熟的人卵母细胞中估计有300000~400000个线粒体。

卵母细胞特异性基因在卵泡发育成熟、受精及着床前的发育等过程中发挥关键作用。其中Figla、Sohlh1和Lxh8的表达是裸卵母细胞形成卵泡的必要条件，而Nobox是始基卵泡募集为初级卵泡的关键基因。Dazl、Cpeb1和Ybx2(以前称为Msy2)是调节卵母细胞内mRNA表达的DNA或RNA结合蛋白。此外，卵母细胞外基质和透明带(zonapellucida,ZP)的形成伴随着卵母细胞的发育过程。

透明带对发育中的卵母细胞、输卵管中的排卵卵泡以及卵裂期的胚胎均发挥重要的保护作用。透明带保护卵泡中正在发育的卵母细胞、输卵管中的排卵卵泡以及卵裂期胚胎。它作为与精子接触的初始部位，在受精后，成为阻止多精子穿透的屏障。Zp1(Zpa)、Zp2(Zpb)和Zp3(Zpc)是编码透明带主要硫酸化糖蛋白的三个基因。ZP2和ZP3蛋白聚合物形成的花环体被ZP1蛋白贯穿连接，形成透明带的亚单元。Figla调节卵母细胞生长过程中上述基因的协调表达。研究显示，人类和大鼠有第四个ZP1样亚基(ZP4)，而小鼠没有。多年来 ZP3被认为是小鼠中主要的精子受体，ZP2是次要的受体。然而，现有的证据表明识别ZP2氨基末端的特定区域是小鼠和人的精子成功穿透透明带的必需条件。受精后，从卵子中释放出名为卵黄素的皮质颗粒金属蛋白酶可切割ZP2，阻止其余的精子与ZP结合，以防止多精子受精。缺乏ZP1的小鼠表现为透明带的结构异常和繁殖力的降低;缺乏 ZP2 的小鼠表现为薄型透明带，缺乏排卵前卵泡,繁殖期小鼠卵巢中窦卵泡数量显著减少,排卵减少并且不能形成两细胞期胚胎。而且对ZP2缺乏的雌性小鼠的卵母细胞进行体外受精，形成的囊胚不能正常发育。缺乏ZP3的小鼠虽然其他透明带蛋白均可正常表达,但不能形成透明带也几乎不能排卵，且缺乏生育能力。与ZP2突变小鼠一样，ZP3 缺陷小鼠的体外受精卵发育不会超过囊胚期。

此外，通过小鼠模型鉴定出了一系列卵母细胞特异性的“母体效应”基因,这些基因在卵母细胞中表达，但仅在着床前胚胎发育过程中发挥作用。其中NIrp5、Khdc3、Ooep和Tle6基因编码的蛋白质在卵母细胞中形成皮层下母源复合体(subcortical maternal complex SCMC)。此外，基于其在卵母细胞和卵裂期胚胎中的相似定位模式,肽酰基天冬氨酸二硫异构酶V型(PADI6)也可在该复合体中发挥作用。缺乏Nrlp5、Padi6 或Ooep的小鼠卵母细胞没有细胞质网格(cytoplasmic lattices，CPLs),合成蛋白质的能力缺陷，且受精后不能发育。 KHDC3 调节卵母细胞和早期胚胎的纺锤体功能;Khdc3敲除的雌性小鼠的胚胎由于非整倍体的发生率高而发育不良。与NIrp5相关的基因NIrp2在卵泡发育过程中的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达，也是早期胚胎发育成功所必需的母体蛋白编码基因。小鼠卵母皮层下母源复合体基因与人卵母细胞具有相同的表达模式，且功能相似。TLE6 磷酸化位点纯合点突变的女性通常由于受精后胚胎分裂失败而不育。同样，缺乏 PADI6 的人卵母细胞受精后发育停滞。随着研究的不断深人，逐渐发现了一系列“母体效应基因”，如Zar1(zygote arrest 1)编码的细胞质蛋白决定受精卵向裂解胚胎转变过程，但机制尚不明确;Gclm(glutamate cysteine ligase,modifier subunit)编码调节谷胱甘肽合成的蛋白,是控制细胞氧化还原状态的关键成分，缺乏GCLM的小鼠胚胎不能发育成囊胚;Npm2(nucleoplasmin 2)是卵母细胞成熟前编码产生的一种核蛋白,影响异染色体的重组和组蛋白去乙酰化，缺乏NPM2 的卵子可以正常排卵和受精,但往往无法完成着床前胚胎发育;Dppa3除了在原始生殖细胞中发现的作用外，也是着床前胚胎正常发育所需的母体效应基因。

一系列的证据表明卵母细胞决定卵泡的发育进程。卵母细胞对卵泡生长的调控作用主要是通过由卵母细胞产生的卵母细胞选择性或特异性TGF-β超家族成员例如生长分化因子-9(growth differentiation factor-9GDF-9)和骨形态发生蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)介导。通过对小鼠的基因干预和绵羊中编码 GDF-9 和BMP-15基因自发突变体表型的观察，可明确GDF-9和BMP-15在卵泡发育过程中的重要作用。在人卵母细胞中亦发现高表达的GDF-9 和BMP-15与随后卵母细胞和胚胎的整体质量密切相关。

(1)GDF-9:GDF-9由5q31.1染色体上的基因编码，在卵母细胞和灵长类的颗粒细胞中高表达。GDF-9缺陷小鼠的卵泡生长停滞在初级阶段,但卵母细胞以比野生型卵母细胞更快的速度继续发育，并发展成为正常小鼠的窦卵泡时期的卵母细胞。然而，由于颗粒细胞与卵母细胞之间的相互连接的超微结构的异常,最终卵母细胞死亡,仅留下一条透明带。与此同时，GDF-9缺陷小鼠卵泡周围不形成卵泡膜，提示GDF-9参与卵泡膜的组成或细胞增殖的调控。相反地，在大鼠中的研究发现,添加 GDF-9可刺激初级卵泡的生长,与缺乏GDF-9的小鼠在初级阶段的阻滞相一致。GDF-9通过与激活素样受体(ALK)-5(TGF-βRI)和2型 BMP受体(BMPR-2)受体复合物的相互作用,对颗粒细胞和卵泡膜细胞发挥调控作用,并日具有显著的种属特异性。在啮齿动物中，GDF-9刺激颗粒细胞分化，包括诱导黄体生成系(luteinizing hormone,LH)受体和甾体生成。在卵丘细胞中，GDF-9促进透明质酸合成酶2、五肽3和肿瘤坏死因子诱导基因6(TSG-6)的表达，后者转录的蛋白质参与卵丘复合体的蛋白多糖细胞外基质的形成。GDF-9刺激COX-2和前列腺素的合成和孕酮的分泌，同时还抑制尿激酶的表达,并抑制卵丘细胞LH受体的表达,止卵丘细化。暴露于最高浓度的GDF-9有助于卵母细胞周围颗粒细胞的独特表型的形成。GDF-9在体外刺激人卵泡膜细胞增殖,抑制其类固醇生成,与小鼠卵巢中GDF-9在调控卵泡膜发育的作用模式一致。

(2)BMP-15:也称为GDF-9b，由X染色体上的基因编码，是卵母细胞产生的TGF-β超家族的另一重要成员。它在结构上与GDF-9相似，并且具有相似的表达模式。小鼠Bmp15基因的靶向性敲除导致卵巢形态异常、排卵和受精率显著降低，从而导致其生育力显著下降。Bmp15和Gdf9突变的杂合子小鼠由于卵泡生成和卵丘细胞功能异常导致生育能力严重受损。然而，绵羊Bmp15基因的自发性突变体(如Inverdale和Hanna绵羊)的表现与 Bmp15基因敲除的小鼠完全不同。在杂合状态下，卵泡排卵数量反而增加，从而增加了繁殖力。但在纯合性突变的母羊中观察到与Gdf9 敲除的小鼠相似的原发性卵巢衰竭表型。在体外,BMP-15促进颗粒细胞有丝分裂。因此,体内BMP-15的缺乏可能导致与纯合突变绵羊体内类似的卵泡发育障碍。BMP-15的受体是由BMPR1B(ALK6)和BMPRII组成的受体复合物。根据突变等位基因拷贝数的不同，Booroola绵羊BMPR-1B的点突变与排卵率的增加有关。小鼠中Bmpr2基因的靶向性缺失不影响卵泡发育，却因为卵丘细胞膨胀的缺陷阻止了体内受精导致小鼠不孕。

BMP-15和kit配体之间以负反馈方式相互作用:BMP-15刺激颗粒细胞kit配体的表达而kit配体抑制BMP-15在卵母细胞中的表达。在卵母细胞的存在下，BMP-15和 kit配体促进颗粒细胞的有丝分裂。而kit(kit配体受体)只在卵母细胞表达，并且kit配体抑制卵母细胞BMP-15(颗粒细胞有丝分裂原)的表达，这表明卵母细胞可能产生其他颗粒细胞有丝分裂原。

GDF-9和BMP-15先以二聚体的前体蛋白合成，然后经蛋白水解以产生生物活性分子。值得注意的是,使BMP-15失活的Inverdale绵羊突变极大地损害了突变型BMP-15和野生型GDF-9在共表达细胞内的蛋白质水解过程。因此Inverdale羊表型发生的原因至少一部分是由于突变型BMP-15对野生型GDF-9再修饰的干扰而引起的GDF-9功能的缺乏。相同地,人共表达细胞BMP-15和GDF-9突变可能导致翻译后加工受损,降低功能蛋白的产生，从而导致相关的卵巢早衰的发生。研究发现，不仅GDF-9和BMP-15的同源二聚体具有生物活性。这两种蛋白的异源二聚体在调节颗粒细胞存活、颗粒细胞支持卵母细胞代谢的功能、成熟过程中卵丘细胞的扩张等方面都具有非常强的生物活性。因此，GDF-9:BMP-15异二聚体可能才是卵母细胞分泌的必需功能配体。

(二)颗粒细胞

颗粒细胞起源于卵巢表面上皮,具有两种形成波。第一波参与卵巢髓质卵泡的形成,第二波参与卵巢皮质中卵泡的形成。颗粒细胞的形成是由GATA结合蛋白4(GATA4)表达细胞驱动的。GATA4WNT4R-spondin1(RSPO1) β-catenin和FOXL2协同促进胎儿期颗粒细胞的发生并调节卵泡生成。包绕每个卵母细胞的颗粒细胞都具有寡克隆起源，成熟卵泡中的颗粒细胞群是由最初的包绕卵母细胞的3~5个具有颗粒细胞潜能的细胞发育而来。颗粒细胞是卵巢雌二醇、抑制素和激活素的主要来源，并为卵母细胞发育成熟提供必需成分。但由于卵泡基底层将颗粒细胞与卵泡膜的血管分离，形成一个相对的血液屏障，故颗粒细胞不直接接受血液供应，所以限制了白细胞和高分子物质(如低密度脂蛋白)的进人。因此，相邻的颗粒细胞和卵泡细胞间的细胞连接作用尤为重要。

颗粒细胞通过广泛的缝隙连接网络相互连接，为相邻细胞之间的小分子代谢交换和传输提供重要途径。每个颗粒细胞间隙连接的数量随着卵泡的发育而增加，将它们连接成一个功能性整体。此外，颗粒细胞通过细胞质突触穿过透明带，与卵母细胞的细胞膜形成缝隙连接。缝隙连接由称为连接蛋白的六连环蛋白质组成。Connexin-37和Connexin-43 是最重要的两种卵泡连接蛋白,它们形成具有不同通透性的间隙连接。

Connexin-37是卵母细胞中的主要连接蛋白，而Connexin-43在颗粒细胞中占优势，然而至少围绕卵母细胞周围的第一层颗粒细胞也表达Connexin-37。颗粒细胞与卵母细胞之间的通信是通过同型Connexin-37缝隙连接而进行的，而颗粒细胞之间的缝隙连接是通过同型 Connexin-43复合物进行的。卵丘细胞局部诱导颗粒细胞Connexin-43表达。卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormoneFSH)TGF-31和卵丘细胞分泌的全反式维甲酸均促进颗粒细胞 Connexin-43表达。在窦卵泡中，颗粒细胞通过缝隙连接运输cGMP来抑制卵母细胞恢复减数分裂。LH的排卵高峰抑制Connexin-43mRNA的表达，并导致丝裂原活化激酶介导的 Connexin-43的磷酸化,最终导致缝隙连接关闭，细胞间代谢偶联中断。

Connexin37和Connexin43敲除的小鼠的卵巢表型进一步阐述了连接蛋白对卵泡功能的重要性。在通过靶向Gja4基因构建的Connexin 37缺乏型小鼠卵巢中,卵泡生长停滞在窦前卵泡;卵母细胞的生长虽然开始，却在减数分裂能力恢复之前停滞,导致卵母细胞的丢失和黄体化结构的形成。以Gja1基因为靶点构建的Connexin-43缺陷小鼠具有卵巢功能的异常,特征是生殖细胞数量减少和初级阶段以后卵泡生长受损。其他连接蛋白亦在卵巢中表达,但它们的特异性功能尚不清楚。

颗粒细胞表达大量细胞因子的受体并对这些因子做出反应，这些因子要么来源于卵泡局部,要么从血液进入卵泡腔。这些因素包括卵母细胞衍生因子、颗粒细胞自身产生的自分泌/旁分泌因子、卵泡膜细胞的产物以及来源于垂体和其他组织(如脂肪)的循环因子。除了FSH和LH,已证实体内、外存在众多影响灵长类动物以及其他动物颗粒细胞的信号分子，包括下丘脑因子[如促性腺激素释放激素和吻素(kisspeptin)]、其他垂体激素(如生长激素和催乳素)、大量生长因子[如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)]家族成员、TGF-B家族成员、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factorIGF)和控制代谢的激素(如胰岛素)、血管张力素、血管生成因子、细胞因子(如TNF-a)和脂肪代谢相关因子(如瘦素、脂联素)等。

根据与人类突变或动物自发或诱发基因突变相关的表型研究中阐述了这些因子的关键作用,如前所述的GDF-9和BMP-15。但这些因子作用的主次和时间顺序还未得到很好的阐述。除了颗粒细胞表面受体的表达，微管系统和外泌体亦参与卵泡内的信号通信，例如以 microRNAs为代表的外源性调节因子等。

此外，虽然前文提出颗粒细胞都是寡克隆起源，但根据其在卵泡内的位置而表现出显著的表型差异。主要由于它们与卵母细胞和卵泡膜细胞的距离不同,对其释放的旁分泌物质反应而导致位于基底层附近的壁颗粒细胞、位于窦腔的颗粒细胞和卵丘颗粒细胞各自具有独特的特征。窦卵泡壁颗粒细胞表现出最大的类固醇生成活性。此外，排卵前卵泡壁颗粒细胞LH受体水平最高,最靠近窦腔的颗粒细胞类固醇生成酶的表达较低，而中间区域的颗粒细胞比窦壁颗粒细胞具有更大的有丝分裂活性。

在排卵时随卵母细胞释放的卵丘细胞不表达芳香酶，其LH受体含量和LH反应性水平明显低于壁细胞。在小鼠中发现，卵丘细胞具有独特的基因表达模式，包括编码钠偶联中性氨基酸转运体基因Slc38a3的表达，以及更高水平AMH的表达。在卵母细胞分泌的 GDF-9和BMP-15的作用下，靠近窦腔的卵丘细胞和颗粒细胞不表达mTOR信号传导的抑制剂 DDIT4L,而壁颗粒细胞表达高水平的该蛋白。因此，卵丘细胞中的细胞代谢调节剂mTOR活性最高,使其更好地为卵母细胞的生长发育提供所需要的营养物质。卵丘细胞在LH峰后增殖，在排卵刺激产生的前列腺素的作用下，产生由透明质酸、蛋白聚糖和蛋白聚糖结合蛋白组成的细胞外基质。这种基质的形成导致卵丘-卵母细胞复合体的排卵前扩张，为排卵做准备。此外，不同颗粒细胞前列腺素E受体的不同表达模式允许颗粒细胞亚群在排卵期间对PGE，做出独特的反应。黄素化的卵泡颗粒细胞经过终末分化，产生大量的黄体细胞群。由于黄体新生血管化，颗粒-黄体细胞可从循环脂蛋白获取更多胆固醇,合成孕酮的能力显著增加。颗粒-黄体细胞还保留了从卵泡黄素细胞产生的雄激素前体合成雌激素的能力。